Imagej średnia ruchoma

Wskazówki dotyczące mikroustawiania AF autorstwa Johna Reilly'ego (neuroanatomist) Autofocus micerejustment (AFMA) to procedura, która pozwala użytkownikowi skorygować małe błędy przedniego lub tylnego ogniskowania. Jest to funkcja dostępna tylko w niektórych modelach Canon dSLR (obecnie 50D, 7D, 5D Mark II, 1D Mark III, 1D Mark IV, 1Ds Mark III i 1D X). AFMA przyniesie największą korzyść soczewkom z szybkimi otworami (f2.8 i szerszym), ponieważ cienka głębia ostrości przy szerokich otworach sprawia, że ​​nawet małe błędy ostrości stają się bardziej widoczne. Ta wskazówka zawiera dwie główne sekcje, praktyczne podsumowanie procedury dla tych, którzy chcą nurkować bezpośrednio, a następnie dyskusję bardziej techniczną, w tym niektóre opcje majsterkowania dla konfiguracji testowej. Najłatwiejszym sposobem wykonania AFMA jest komercyjne narzędzie, takie jak LensAlign MkII lub DataColor SpyderLensCal (zobacz omówienie poniżej, aby wyjaśnić typowe usterki wydrukowanych map testowych i wzorów mory oraz uzasadnione obejście). Ustaw narzędzie na stole lub najlepiej na małym statywie i ustaw aparat na stabilnym statywie. Odległość między narzędziem do kalibracji a kamerą powinna wynosić około 25-krotność ogniskowej obiektywu (na przykład 85 mm x 25 2,1 m 7 stóp), chociaż w dowolnym miejscu w zasięgu 5-50x będzie działać. Należy pamiętać, że odległość 25-krotnej ogniskowej jest niezależna od wymiaru czujnika. 7 stóp byłoby odpowiednie dla obiektywu 85 mm w APS-C, APS-H lub FF. Jeśli dostosowujesz obiektyw zmiennoogniskowy, ustaw odległość na najdłuższej ogniskowej i wykonuj kalibrację przy jak najdłuższej ogniskowej (zwróć uwagę, że nowy 1D X pozwala skalibrować obiektyw zmiennoogniskowy z dwiema oddzielnymi wartościami regulacji, dla długich i szerokie końce). W przypadku długich obiektywów potrzebujesz dużej ilości miejsca. Wyceluj kamerę tak, aby środkowy punkt AF był wyśrodkowany na celu ustawiania ostrości, a następnie wyrównaj kamerę tak, aby płaszczyzna czujnika była równoległa do celu ustawiania ostrości (za pomocą celownika w soczewce LensAlign lub przez zapewnienie obydwu poziomów dla SpyderLensCal). Ważne jest oświetlenie - najlepiej stałe, jasne światło zarówno dla celu ogniskowania, jak i linijki, z oświetleniem dla tych drugich pod kątem, aby uniknąć odbicia. Sugeruję użycie pary lampek biurkowych, jedna zaświecająca linijkę pod dużym kątem, a druga oświetlająca cel skupienia. Właściwie używam trzech lamp, z których każda ma odpowiednik 150 W. Oto jak wygląda moja typowa konfiguracja: Jeśli jest to wygodne, skonfiguruj, aby strzelać na uwięzi (musisz przejrzeć obrazy w wieku 100). Ustaw aparat w trybie Av, maksymalnym otworze przysłony iw tym celu najlepiej jest robić zdjęcia w formacie JPG przy ustawieniu stylu obrazu na Monochromatyczny (jeśli fotografujesz w kolorze z obiektywem takim jak 50L lub 85L, przygotuj się na wiele podłużnych zdjęć CA). Użyj zdalnego wyzwalacza lub samowyzwalacza i funkcji blokady lustra. Przejdź do ustawienia C. Fn w celu dopasowania mikrofonu (w sekcji AutofocusDrive) i wybierz 2: Regulacja za pomocą obiektywu. W tym momencie istnieje wiele sposobów na wykonanie zdjęć próbnych. Możesz wykonać sekwencję bracketingu w trybie -20, -10, 0, 10 i 20 i sprawdzić, która para ustawień jest ustawiona na punkt zerowy linijki, a następnie zawęź ją. Możesz też fotografować przy każdym ustawieniu od -20 do 20. Ważne jest, aby wykonać kilka ujęć w każdym ustawieniu AFMA, a nie tylko jeden lub dwa, szczególnie w regionie, w którym kończy się regulacja, i wykonać co najmniej kilka zdjęć od nieskończoności, a niektóre od minimalnej odległości ogniskowania (MFD). Oto moja strategia: wykonaj jedno uderzenie na zero i sprawdź fokus przedni lub tylny (np. Jeśli płaszczyzna ogniskowania znajduje się przed punktem zerowym na linijce, to fokus przedni). Ogniskowanie z przodu wymaga pozytywnej korekty, poprawa ostrości wymaga negatywnej regulacji. Fotografuję pojedyncze ujęcia zaczynając od ostrości nieskończoności i sprawdzając maksymalne powiększenie na tylnym wyświetlaczu LCD, z przyrostem o 5 jednostek, a następnie zwężając dalej, aż do uzyskania domyślnego ustawienia AFMA dla tego obiektywu. Następnie strzelam w sumie 11 ustawień AFMA 5 jednostek po każdej ze stron mojego wstępnego wyboru. Przy każdym ustawieniu wykonuję osiem ujęć, dwa zaczynając od nieskończoności, następnie dwa bez ponownego ustawiania ostrości, następnie dwa zaczynając od MFD, a następnie dwa kolejne bez ponownego skupiania. Następnie przesyłam obrazy do komputera i sprawdzam je na 100. Program DPP pokaże ustawienie AFMA jako część danych EXIF ​​(lub możesz umieścić notatkę post-it w celu przy bieżącym ustawieniu). Zignoruj ​​wszelkie nieostre strzały, w których żadna część linijki nie jest wyraźna. Ogólnie uważam, że gdy przechodzę przez obrazy, gdy zbliżam się do najlepszej regulacji, strzały z nieskończoności będą wyłączone, wtedy przy najlepszej regulacji wszystko będzie na miejscu, a kiedy odejdę, strzały z MFD będą wyłączone, lub odwrotnie. Dla mnie cały proces trwa około 30 minut na połączenie obiektywów. Często widzę, że 3-4 wartości regulacji wyglądają dobrze (na przykład od 1 do 3, więc używam tylko średniej), zwykle szerszy obiektyw z przesłoną o cieńszym DoF daje bardziej ścisły zakres. Kilka innych ważnych ciekawostek: aparat może zapamiętać do 20 specyficznych dla soczewek regulacji dostosowań za pomocą obiektywu, więc jeśli masz więcej niż jedną kopię obiektywu, aparat nie może ich rozdzielić (chociaż 1D X może je odróżnić na numerze seryjnym obiektywu) soczewka z przedłużaczem liczy się jako dodatkowa soczewka (i musi być skalibrowana oddzielnie od gołego obiektywu). To jest wersja krótka na więcej szczegółów i teorii, lub jeśli wolisz, przejdź do samego końca dla sugestii DIY, aby zastąpić komercyjne narzędzie kalibracji. Dlaczego mikroskształcenie AF jest ważne Kamerki i soczewki są wytwarzane na liniach montażowych, a tolerancje odnoszą się do dowolnego procesu produkcyjnego o pożądanej specyfikacji i zakresie dopuszczalnych wartości w tym zakresie. Jeśli masz szczęście, dostaniesz aparat i obiektyw, które są zarówno na miejscu, lub są wyłączone o tę samą kwotę w tym samym kierunku, a życie jest dobre. Jeśli masz wiele soczewek i ciał, istnieje szansa, że ​​jedna lub więcej osób będzie wymagać pewnych korekt. Drugim czynnikiem jest głębia ostrości (DoF), im szersza jest przysłona, tym płytszy charakter DoF. Przy względnie węższych aperturach, takich jak zakres f3,5-5,6 powszechnie spotykany w obiektywach zmiennoogniskowych konsumentów, pole DoF jest wystarczająco głębokie, aby maskować drobne błędy skupienia, więc AFMA nie jest tak ważna w tych przypadkach. Ale dzięki szybkim obiektywom, które uzyskują płytki DoF, nawet małe błędy ostrości są bardzo widoczne. Przed udostępnieniem AFMA, jedyną opcją rozwiązania tych problemów było przesłanie aparatu (ów) i obiektywu (ów) do firmy Canon i wysłanie do nich całego zestawu. Potrzeba profesjonalnych fotografów, którzy to zrobili, była jednym z powodów, dla których Canon uruchomił Canon Professional Services. Co to jest mikroskształcenie AF AFMA koryguje odchylenie w systemie AF lub inaczej, poprawia ogólną dokładność systemu AF. Terminy dokładność i precyzja są czasem (niewłaściwie) używane zamiennie - dokładność jest zbliżona do prawdziwej, a dokładność to powtarzalność. Oto przykład schematyczny: AFMA koryguje dokładność, ale nie robi nic dla precyzji. W efekcie porusza punkt środkowy - średnią płaszczyznę ogniskową wielu pomiarów. Ale ważne jest, aby pamiętać, że precyzja odgrywa ważną rolę, więc jeśli przetestujesz swój system AF za pomocą tylko jednej lub kilku prób, przypadkowa szansa mówi, że twój test nie zostanie wykryty z powodu niedokładności. Tak więc, podczas testowania wydajności AF, należy wykonać wiele testów dla danego obiektywu, a mniej obiektywnych testów będzie potrzebnych dla obiektywu o ogniskowej F2,8 lub szybszej ze względu na większą precyzję punktu AF aktywowaną przez taki obiektyw. Podejrzewam, że jest to za stwierdzeniem Canonsa, że ​​AFMA może zapobiec poprawnemu ustawieniu ostrości - jeśli opierasz regulację na jednym lub dwóch próbnych zdjęciach, a te strzały były stosunkowo daleko od prawidłowej płaszczyzny ogniskowej, wtedy średnio większość twoich kolejnych ujęć straci ostrość . Warto zauważyć, że chociaż testujemy i ustawiamy AFMA na podstawie głębi ostrości, to w rzeczywistości mamy do czynienia z głębią ostrości. Ma to sens, ponieważ system AF nie może kontrolować czego przed obiektywem, ale może kontrolować, co dzieje się za obiektywem. Głębia ostrości odnosi się do obszaru krytycznego skupienia otaczającego czujnik, a ten obszar jest ułamkiem grubości milimetra. Firma Canon precyzuje precyzję systemu AF w zakresie jednej głębi ostrości dla maksymalnej wartości przysłony obiektywu dla punktów AF o standardowej precyzji oraz w zakresie 13 głębi ostrości dla maksymalnej wartości przysłony obiektywu dla precyzyjnych punktów AF, które są aktywowane przez szybsze soczewki (punkt środkowy f2,8 punktu na większości ciał, punkt środkowy f4 na korpusach serii 1). Jedna jednostka AFMA równa się 18 stopniowi ostrości danego obiektywu z maksymalną wartością przysłony. Żaden aparat nie będzie wytwarzał idealnie zogniskowanego obrazu za każdym razem przy każdej odległości, a żadna procedura regulacji tego nie zmieni. To, co potrafi odpowiednia AFMA, to zwiększenie procentu ujęć, które są prawidłowo ustawione. Czy istnieje jeszcze lepszy sposób Jeśli procedura wydaje się dużo pracy, to tak, prawie na pewno są lepsze sposoby. W poście na forum Canon Rumours użytkownik epsiloneri opisał metodę analizowania kontrastu celu skupienia (standardowe odchylenie intensywności pikseli) i nanoszenia danych z dopasowaniem krzywej parabolicznej w celu określenia najlepszego ustawienia AFMA. Wygląda to na bardzo dokładną metodę, choć prawdopodobnie zbyt nużącą, bez możliwości zautomatyzowania analizy (np. MATLAB lub ImageJ). Teoretycznie powinno być możliwe uzyskanie dokładnego ogniskowania za pomocą wykrywania kontrastu w trybie podglądu na żywo, gdzie nie jest konieczne wyrównanie, ponieważ czujnik obrazu służy do określenia najlepszego ogniska, a następnie porównać to z AF wykrywania fazy i odpowiednio skorygować. W praktyce jest to coś, co jest trudne do zrobienia (ponieważ przesunięcie pierścienia ostrości, aby zobaczyć, czy jesteś naprawdę optymalnie nastawiony, zmienia skupienie i tracisz punkt zerowy). Jest to jednak pomysł, który Canon mógłby wdrożyć jako półautomatyczną rutynę, tj. Skonfigurować i wyrównać cel (Canon mógłby go sprzedać i odpowiednio przeładować, tak jak robią to za inne małe kawałki plastikowego kaszlu), po czym aparat automatycznie określa optymalną regulację. Złożyć plik pod jednym dachem, czy nie byłoby to miłe Jeśli to dobrze zrobione, czy będzie idealne Nie, system AF nigdy nie będzie doskonały. Jest kilka ważnych powodów. Pierwszym z nich jest to, że każdy system cierpi na przypadkowość, a dokładny AFMA ma na celu zmaksymalizować częstotliwość otrzymywanych fokusów, ale nadal będzie trochę chybionych. Innym powodem jest to, że cel ogniskowania jest idealną sytuacją płaską z dużym kontrastem. Świat nie składa się z celów fokusowych - gdyby tak było, fotografia byłaby dość nudna. Złożoność scen świata rzeczywistego dodatkowo potęgują nasze oczekiwania. Celujesz w aparat i ostrożnie umieszczasz punkt AF na obiekcie, na którym chcesz się skupić. Jednak system AF nie może odczytać twojego umysłu, tylko to, co może zrobić, to zablokować obszar największej różnicy fazy w obszarze punktu AF. Zwróć uwagę, że rzeczywisty punkt AF jest większy niż małe pole reprezentujące punkt w wizjerze. Nawet w przypadku funkcji Spot AF w niektórych aparatach (7D, 1D Mark IV i 1D X), która zmniejsza skuteczny rozmiar punktu AF, rzeczywisty obszar wrażliwy jest równy lub nieco większy niż reprezentacja w wizjerze. Tak więc, w przypadku niektórych obiektów, szczególnie pod ostrym kątem do kamery o cienkim polu DoF, punkt AF może zablokować jedną z dwóch różnych funkcji, dając zauważalnie różne płaszczyzny ogniskowania. Oba byłyby poprawne w odniesieniu do systemu AF. Darmowe metody testowania, co jest z nimi nie tak Istnieje kilka podejść do wykonywania AFMA bez jednego z komercyjnych narzędzi. Jednym z nich jest ustawienie na monitorze komputera wzoru nakłaniającego do mory i ocena ostrości na podstawie podglądu na żywo na tylnym wyświetlaczu LCD aparatu. To dość łatwa metoda, ale ma dwa problemy. Po pierwsze, trudno jest wyrównać ustawienia, aby czujnik był równoległy do ​​ekranu LCD. Po drugie, zauważyłem, że w metodzie obserwowania wzoru mory przy 10-krotnym podglądu na żywo istnieje wiele niedokładności, kamera może być przenoszona w przód i w tył, nie zauważając widocznych zmian w wzorze na tylnym wyświetlaczu LCD. Inne bezpłatne podejście obejmuje wykres, który można pobrać i wydrukować, a następnie ustawić pod kątem 45 ° do kamery, ustawić ostrość na ciemnej linii i użyć skali po bokach, aby sprawdzić ostrość. Problem polega na tym, że cel skupienia (linia) i skala DoF są w tej samej 45 płaszczyźnie, więc cel nie jest ortogonalny względem czujnika. Właściwie to, co jest prawdopodobnie najbardziej popularną wersją tego wykresu, miało starszą wersję (wciąż dostępną), w której wydrukowano dwie strony, a następnie wycięto jedną jak starą kartę. Zabawki z automatu typu B wycięte z pudełka na płatki i przyklejone do druga strona. Twórca zatrzymał to podejście ze względu na zmienność złożenia prowadzącą do zmiennych wyników. Obecna wersja używa ciemnej poziomej linii jako celu skupienia, z uzasadnieniem, że ponieważ linia jest pozioma, nie ma znaczenia dla systemu AF, że strona jest pod kątem, nadal pokazuje się jako pozioma linia 2D. To prawda, ale wtedy optymalnie aktywuje tylko poziomą, zależną od linii część punktu AF. Na wielu kamerach to nie zadziała dobrze. Obecny xxD i czujnik 7Ds f2.8 to para ukośnych linii, co oznacza, że ​​cienka, czarno-biała linia zorientowana poziomo nie aktywuje tego czujnika. W przypadku linii RebelxxxD i 5D5DII, czujnik f2.8 jest pionowym czujnikiem liniowym, który ignoruje poziomą linię na wykresie. Tak więc, linia pozioma aktywuje tylko poziomą czułość fazową f5,6 pionowego czujnika krzyżowego w środkowym punkcie AF. Być może zastanawiasz się - dlaczego facet tak sporządził wykres, że zgaduję, ponieważ zaprojektował go do testowania AF w aparatach Nikon, które nie mają wysokiej precyzji punktu AF - ich czujniki krzyżowe są f5,6- czułe w obu orientacjach, więc pozioma linia celu powinna być w porządku. Lepsze podejście do majsterkowania Jeśli raczej nie kupisz komercyjnego narzędzia do AFMA, moją radą będzie odtworzenie ważnych funkcji tych narzędzi za pomocą niedrogich zamienników. Oto co polecam. Wymagałoby to tekturowego pudełka, książki, taśmy mierniczej, pałeczki do jedzenia lub ołówka oraz wydruku tego celu (dzięki Bobowi Bobowi za link). Można go ustawić na stole, a nawet na podłodze, jeśli to konieczne. Jeśli masz dobry statyw, używałbyś tego zamiast ustawiania kamery na książce. Cel ogniskowy zostaje przyklejony do pudełka, z dołu do dołu, a chopstickpencil utknie na krawędzi pudełka, pionowo wycentrowany na celu. Pałeczka obsługuje taśmę pod kątem. Zanotuj pomiar na taśmie mierniczej w miejscu, w którym przechodzi obok celu - to jest twój punkt zerowy, przed którym możesz ocenić przednie lub tylne ogniskowanie (gdy przeglądasz swoje obrazy w wieku 100 na twoim komputerze). Wybierz książkę o grubości, która centruje soczewki na w przybliżeniu na taką samą wysokość, jak środek tarczy ostrości. Konfiguracja wyglądałaby mniej więcej tak: mam nadzieję, że wyjaśni to pewne pułapki w systemach AF oraz zalety i procedury uzyskania użytecznego AFMA. Happy (i Sharp) Shooting Listopad 04, 2017 Poniższe informacje są zaktualizowaną wersją metody wykorzystywania ImageJ do analizy western blots ze starej, przestarzałej strony. Jeśli szukasz bardziej wszechstronnej opcji workflow do analizy Western blot, odwiedź mój samouczek dotyczący korzystania z Image Studio Lite. pakiet wolnego oprogramowania od LI-COR Biosciences. Oprogramowanie Image Studio Lite można pobrać bezpłatnie z licorislite. Oprócz funkcjonalności opisanej poniżej dla ImageJ, Image Studio Lite oferuje dodatkowe funkcje zarządzania danymi wraz z narzędziami do adnotacji do tworzenia gotowych do publikacji obrazów waszych westernów. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) może być użyty do porównania gęstości (aka intensywności) prążków na żelu agarowym lub western blot. Ten samouczek zakłada, że ​​przeprowadziłeś żel lub zmaza przez etap wizualizacji, dzięki czemu masz cyfrowy obraz swojego żelu w. tif. jpg. png lub inne formaty obrazu (16-bitowy. tif byłby preferowanym formatem do zachowania maksymalnej ilości informacji w oryginalnym obrazie). Jeśli skanujesz film rentgenowski na płaskim skanerze, upewnij się, że korzystasz ze skanera z możliwością skanowania folii (tzn. Filmu) i użyj oprogramowania skanera, aby zapisać 16-bitowe obrazy tiff. Zobacz odniesienia na końcu tego samouczka, aby omówić różne sposoby wkręcania tego kroku. Zakłada to również, że nie udało ci się prześwietlić obrazu z plam, kiedy go wyprodukowałeś. Aby uzyskać wyjaśnienie, dlaczego nadmierna ekspozycja zniszczy twoje wyniki, zobacz tę stronę. Opisana tutaj metoda wykorzystuje metodę analizy żelu opisaną w dokumentacji programu ImageJ: Analiza żelu. Możesz go używać zamiast metod, które opisuję poniżej. Różnica między wynikami uzyskanymi z różnych metod powinna być bardzo niewielka. Ta wersja samouczka została utworzona przy użyciu ImageJ 1.42q na 64-bitowej instalacji Windows 7. 1. Otwórz plik obrazu za pomocą FilegtOpen w ImageJ. 2. Procedura analizy żelu wymaga, aby obraz był obrazem w skali szarości. Najprostszą metodą konwersji na skalę szarości jest przejście do ImagegtTypegt8-bit. Twój obraz powinien wyglądać jak na rysunku 1. Rysunek 1. Utworzony obraz Western blot otwarty w ImageJ. Informacje u góry obrazu wskazują, że obraz jest obecnie w trybie 8-bitowym, używając odwracającego LUT (tabela przeglądowa). Odwracanie LUT zapewnia, że ​​ciemne prążki zostaną zapisane jako wartości o wyższej gęstości. 3. Wybierz narzędzie Zaznaczenia prostokątne z paska narzędzi ImageJ. Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa. ImageJ zakłada, że ​​twoje pasy biegną w pionie (tak, że poszczególne pasy są poziome), więc twój prostokąt powinien być wysoki i wąski, aby zawrzeć pojedynczy pas. Jeśli narysujesz prostokąt, który jest krótki i szeroki, ImageJ przełączy się na założenie, że pasy biegną poziomo (poszczególne pasy są pionowe), co prowadzi do dużego zamieszania. Rysunek 2. Pierwszy pas został wybrany za pomocą narzędzia Zaznaczenia prostokątne. 4. Po narysowaniu prostokąta nad pierwszym pasmem naciśnij klawisz 1 (Command 1 na Macu) (Command 1 na Macu) lub przejdź do AnalyzegtGelsgtSelect First Lane, aby ustawić prostokąt w miejscu. Pierwszy pas będzie teraz podświetlony i będzie miał 1 pośrodku. 5. Za pomocą myszy kliknij i przytrzymaj środek prostokąta na pierwszym pasie i przeciągnij go na następny pas. Możesz także użyć klawiszy strzałek do przesunięcia prostokąta, choć jest to wolniej. Wyśrodkuj prostokąta na linii od lewej do prawej, ale nie martw się o to, że będzie idealnie pasował do tej samej osi pionowej. Obraz-J automatycznie wyrówna prostokąt na tej samej osi pionowej co pierwszy prostokąt w następnym kroku. 6. Naciśnij 2 (Command 2 na Macu) lub przejdź do AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane, aby ustawić prostokąt na drugim pasie. 2 A pojawi się na linii, gdy prostokąt zostanie umieszczony. 7. Powtórz kroki 5 6 dla każdego następnego pasa na żelu, naciskając 2 (Command 2 na Macu) za każdym razem, aby ustawić prostokąt w miejscu (Rysunek 3). Rysunek 3. Umieść prostokąt nad każdą ścieżką, naciskając 2 za każdym razem, aby ustawić prostokąt na miejscu. 8. Po ustawieniu prostokąta na ostatnim torze (naciskając 2), naciśnij 3 (Command 3 na Macu) lub przejdź do AnalyzegtGelsgtPlot Lanes, aby narysować profil profilu na każdym pasie. Rysunek 4. Wykres profilu z przykładu Western blot. 9. Wykres profilu reprezentuje gęstość względną zawartości prostokąta na każdej linii. Prostokąty są ułożone od góry do dołu na wykresie profilu. W przykładowym obrazie typu Western blot pik na wykresie profilu (rysunek 4) odpowiada ciemnym pasom na oryginalnym obrazie (rysunek 3). Ponieważ wybrano cztery ścieżki, na wykresie profilu znajdują się cztery sekcje. Wyższe szczyty oznaczają ciemniejsze pasma. Szersze piki oznaczają pasma, które obejmują szerszy zakres rozmiarów na oryginalnym żelu. 10. Obrazy prawdziwych żeli lub western blotów zawsze będą miały pewien sygnał tła, więc szczytowe wartości don8217t sięgają do linii bazowej wykresu profilu. Rysunek 5 pokazuje pik z prawdziwego blotu, w którym wystąpił szum tła, więc pik wydaje się unosić nad linią podstawową wykresu profilu. Konieczne będzie zamknięcie szczytu, abyśmy mogli zmierzyć jego wielkość. Rycina 5. Prawdziwe zachodnie plamki często mają trochę szumu tła, więc szczyt nie osiąga poziomu aż do linii bazowej (idealnie biały). 11. Wybierz narzędzie do wyboru linii prostej z paska narzędzi ImageJ (rysunek 6). Dla każdego piku, który chcesz analizować na wykresie profilu, narysuj linię w poprzek podstawy piku, aby zamknąć szczyt (rysunek 5). Ten krok wymaga subiektywnej oceny z Twojej strony, gdzie szczyt się kończy i zaczyna się hałas w tle. Rysunek 6. Użyj narzędzia liniowego, aby zamknąć podstawę każdego piku będącego przedmiotem zainteresowania. Figura 7. Pik z Figury 5 jest pokazany z linią narysowaną przez podstawę piku w celu zamknięcia obszaru piku. 12. Zwróć uwagę, że jeśli podświetlonych jest wiele pasów, późniejsze pasy będą ukryte w dolnej części okna wykresu profilu. Aby wyświetlić te linie, naciśnij i przytrzymaj klawisz spacji, a następnie kliknij myszą i przeciągnij wykres profilu w górę. 13. Kiedy każdy wierzchołek zostanie zamknięty w bazie przy pomocy narzędzia wyboru Prosta linia, wybierz narzędzie Różdżka z paska narzędziowego ImageJ (Rysunek 8). Rysunek 8. Wybierz narzędzie Różdżka, aby podświetlić każdy szczyt będący przedmiotem zainteresowania na wykresie profilu. 14. Używając klawisza spacji i myszy, przeciągnij wykres profilu z powrotem, aż wrócisz na pierwszym pasie. Za pomocą narzędzia Różdżka kliknij wewnątrz szczytu (Rysunek 9). Powtórz to dla każdego szczytu, gdy idziesz w dół profilu profilu. Dla każdego podświetlonego piku, wymiary powinny pojawiać się w wyświetlonym oknie Wyniki. Rysunek 9. Kliknij pierwszy wierzchołek interesu za pomocą narzędzia Różdżka. Szczyt powinien być podświetlony, a pomiar powinien pojawić się w oknie wyników. 15. Po podświetleniu wszystkich pików przejdź do AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. To oznacza każdy pik z jego rozmiarem, wyrażony jako procent całkowitej wielkości wszystkich zaznaczonych pików. 16. Wartości z okna Wyniki (Rysunek 10) można przenieść do programu arkusza kalkulacyjnego, wybierając EditgtCopy All w oknie Wyniki. Wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego. Rysunek 10. Wynik wybierania pików na wykresie profilu i oznaczania pików. W takim przypadku wyniki pochodzą z wybrania górnego pasma na każdym z 4 pasów w przykładowej analizie Western z rysunku 1. Uwaga: Jeśli przypadkowo klikniesz w niewłaściwym miejscu za pomocą różdżki. program nadal rejestruje kliknięty obszar jako pik i będzie uwzględniany w całkowitej powierzchni wykorzystywanej do obliczania wartości procentowych. Oczywiście spowoduje to przekrzywienie twoich wyników, jeśli klikniesz w obszary, w których nie ma pików. Jeśli klikniesz w niewłaściwym miejscu, po prostu przejdź do opcji AnalyzegtGelgtLabel Peaks, aby narysować bieżące wyniki, które wyświetlają nieprawidłowe wartości, ale co ważniejsze resetuje licznik w oknie wyników. Wróć do działki profilu i ponownie zacznij klikać w piki, zaczynając od pierwszego szczytu zainteresowania. Okno wyników powinno się wyczyścić i zacząć wyświetlać nowe wartości. Kiedy będziesz się starał, abyś kliknął we wszystkie prawidłowe piki bez przypadkowego kliknięcia w niewłaściwe obszary, możesz wrócić do AnalyzegtGelsgtLabel Peaks i uzyskać poprawne wyniki. Analiza danych Po wklejeniu danych do arkusza kalkulacyjnego można teraz obliczyć gęstość względną pików. Przypominamy, że wartości obliczane przez ImageJ są w zasadzie liczbami arbitralnymi, mają one jedynie znaczenie w kontekście zestawu pików, które wybrałeś na pojedynczym obrazie żelu, nad którym pracowałeś. Nie mają jednostek g białka ani żadnych innych jednostek realnego świata, które można wymyślić. Normalną procedurą jest wyrażanie gęstości wybranych pasm w stosunku do jakiegoś standardowego pasma, które również wybrano podczas tego procesu. 1. Umieść dane w arkuszu kalkulacyjnym. Jeden ze szczytów powinien być twoim standardem. W tym przykładzie użyjemy pierwszego piku jako standardu. 2. W nowej kolumnie obok kolumny Procent, podziel wartość procentową dla każdej próbki przez wartość procentową dla standardu (pierwszy pik w tym przypadku, 26,666). 3. Wynikowa kolumna wartości jest miarą gęstości względnej każdego piku, w porównaniu do wzorca, który oczywiście ma gęstość względną równą 1. Figura 11. Obliczanie gęstości względnej dla każdego z 4 podświetlonych pików. Używamy próbki 1 jako standardu dla tego żelu. Gęstość względną oblicza się, dzieląc wartość procentową dla każdej próbki przez wartość procentową dla wzorca. 4. W tym przykładzie druga linia ma wyższą gęstość względną (1,86), co dobrze koresponduje z rozmiarem i ciemnością tego pasma na oryginalnym obrazie (rysunek 1). Przypomnijmy, że te dane dotyczą górnego rzędu pasm na oryginalnym obrazie Western-blot. 5. Jeśli chcesz porównać gęstość próbek na wielu żelach lub plamach, będziesz musiał użyć tej samej standardowej próbki na każdym żelu, aby zapewnić wspólne odniesienie podczas obliczania wartości gęstości względnej. Więcej informacji na temat tych wymagań można znaleźć w poniższych sekcjach. 6. Aby przetestować znaczące różnice między terapiami w eksperymencie, wszystkie twoje żele lub bloty będą musiały być zeskanowane i określone ilościowo za pomocą tej metody, a wartości będą wyrażone w kategoriach gęstości względnej lub możesz leczyć gęstość względną jako wartość zmiany złożenia (tj. różnica Względna gęstość 2 między kontrolą a terapią wskazywałaby na 2-krotną zmianę w wyrażeniu). Jeśli będziesz używać analizy technik wariancji w celu przetestowania danych, być może będziesz musiał zapewnić, że Twoje wartości gęstości względnej są normalnie rozmieszczone i że istnieje jednorodność wariancji pomiędzy różnymi metodami leczenia. 7. Należy zauważyć, że niektórzy badacze dokładają starań, aby dołączyć szereg seryjnych rozcieńczeń o znanym standardzie do każdej próbki. Korzystając z krzywej rozcieńczenia seryjnego i opisanych powyżej technik kwantyfikacji, powinno być możliwe wyrażanie pasm próbek w postaci pikogramów lub nanogramów białka. Bardziej zaangażowany przykład przy użyciu kontroli ładowania. We8217ll wykorzystamy rysunek 12 jako reprezentatywny western blot. Na tej plamie będziemy udawać, że załadowaliśmy cztery powtórzenia próbki białka (cztery ładunki pipetowe z tej samej fiolki homogenatu), więc spodziewamy się, że gęstości na każdej ścieżce będą równoważne. Górny rząd słupków będzie reprezentował nasze białko będące przedmiotem zainteresowania. Niższy zestaw słupków będzie reprezentował nasze białko kontrolujące ładowanie, co ma na celu zapewnienie, że na każdą ścieżkę załadowano taką samą ilość białka całkowitego. To białko kontrolujące ładunek jest białkiem, które prawdopodobnie ulega ekspresji na stałym poziomie, niezależnie od traktowania stosowanego w stosunku do oryginalnych organizmów, takich jak aktyna (chociaż wiele osób zakwestionuje twierdzenie, że aktyna będzie wyrażana w sposób równoważny w różnych terapiach). Rysunek 12. Przykład Western blot z dolnym rzędem pasm kontroli obciążenia. Często te prążki będą reprezentować białko, które uważa się za wyrażone w sposób równoważny we wszystkich terapiach, takich jak aktyna. Patrząc na Figurę 12, mieliśmy nadzieję załadować równoważne ilości białka całkowitego na każdej linii, ale po przeprowadzeniu analizy Western blot rozmiar i intensywność niższych słupków na każdym pasie zmienia się całkiem sporo. Dwie lewe linie wydają się równoważne, ale trzecia linia ma połowę gęstości (wartość szara) w porównaniu do linii 12, podczas gdy linia 4 ma połowę gęstości i połowę wielkości w porównaniu do linii 12. Ponieważ nasze ustawienia obciążenia są tak różne, gęstość wartości górnego zespołu pasm mogą nie być bezpośrednio porównywalne. We8217ll użyjemy procedury analizy żelu ImageJ8217 do ilościowego określenia gęstości i rozmiaru plamek, i wykorzystamy wyniki z naszych kontroli ładowania (niższe pasma) do skalowania wartości dla naszego białka będącego przedmiotem zainteresowania (górne pasma). 1. Otwórz obraz Western blot w ImageJ. 2. Upewnij się, że obraz jest w trybie 8-bitowym: przejdź do ImagegtTypegt8-bit. 3. Za pomocą narzędzia Prostokąt narysuj pole wokół całego pierwszego pasa (w tym górne i dolne pręty) 4. Naciśnij 822018221 (lub Command 1 na Macu), aby ustawić prostokąt, na środku prostokąta powinien pojawić się 822018221. 5. Kliknij i przytrzymaj w środku prostokąta i przeciągnij go nad drugim pasmem 6. Naciśnij 822028221 (Command 2 na Macu), aby ustawić prostokąt dla linii 2. Na środku prostokąta powinien pojawić się 822028221. Powtórz kroki 5 6 dla każdego następnego pasa, naciskając 822028221 (Command 2 na Macu), aby ustawić prostokąt na każdym kolejnym pasie (patrz Ryc. 13.) Rysunek 13. Każda linia została wybrana poprzez przesunięcie nad nią prostokąta i naciśnięcie 822028221, aby ustawić Prostokąt w miejscu 8. Po umieszczeniu ostatniego pasa (i naciśnięciu 822028221, aby ustawić go na miejscu), można nacisnąć 822038221, aby utworzyć wykres wybranych pasów (patrz rysunek 14). (linia 1 u góry, linia 4 u dołu) on okno, aby zobaczyć wszystkie pasy. 9. Wykres profilu zasadniczo przedstawia średnią wartość gęstości w całym zestawie poziomych wycinków na każdej linii. Ciemniejsze bloty będą miały wyższe szczyty, a bloty obejmujące większy zakres rozmiarów (kD) będą miały szersze piki. W naszym przykładzie Western blot, paski są idealnymi prostokątami, ale zauważysz pewne nachylenie w pikach wykresu profilu, ponieważ ImageJ stosuje uśrednianie wartości gęstości, gdy przesuwa się z góry na dół każdego pasa. W rezultacie ostre przejście od doskonałej bieli do doskonałej czerni na pasach pasa 1 jest tłumaczone na niewielkie nachylenie na wykresie profilu ze względu na uśrednianie. 10. W naszej wyidealizowanej metodzie Western blot nie ma szumu tła, więc szczyt sięga aż do linii bazowej wykresu profilu. W prawdziwych western blotach wystąpi szum tła (tło nie będzie idealnie białe), więc szczyty osiągną poziom wyjściowy wykresu profilu (patrz rysunek 5 powyżej). W rezultacie, każdy dział będzie musiał mieć linię narysowaną w poprzek podstawy piku, aby ją zamknąć. 11. Wybierz narzędzie do wybierania linii prostej z paska narzędzi ImageJ. Dla każdego piku, który chcesz analizować na wykresie profilu, narysuj linię w poprzek podstawy piku, aby zamknąć szczyt (rysunek 7). Ten krok wymaga subiektywnej oceny z Twojej strony, gdzie szczyt się kończy i zaczyna się hałas w tle. 12. Kiedy każdy pik będący przedmiotem zainteresowania jest zamykany narzędziem prostym, przełącz się na narzędzie Różdżka. Będziemy używać narzędzia różdżki, aby podświetlić każdy szczyt będący przedmiotem zainteresowania, tak aby Image-J mógł obliczyć jego względną areadensity. 13. Zaczniemy od podświetlenia pasków kontroli obciążenia (dolny rząd) w naszym przykładzie Western blot. Zaczynając od początku wykresu profilu, użyj różdżki, aby kliknąć wewnątrz pierwszego szczytu (Rysunek 15). Szczyt powinien być podświetlony po kliknięciu. Kontynuuj klikanie na szczyty kontroli obciążenia dla pozostałych pasów. Jeśli ścieżka nie jest widoczna na dole wykresu profilu, przytrzymaj klawisz spacji i kliknij i przeciągnij wykres profilu w górę, aby wyświetlić pozostałe linie. Rysunek 15. Kliknij wewnątrz szczytu kontroli obciążenia narzędziem różdżki. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed. Tau Pathology Induces Excitatory Neuron Loss, Grid Cell Dysfunction, and Spatial Memory Deficits Reminiscent of Early Alzheimers Disease Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y. Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4 ,. Karen E. Duff 1,2,3,5 ,. 1 Taub Institute for Research on Alzheimers Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Department of Integrative Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA Received 20 July 2018. Revised 20 October 2018. Accepted 15 December 2018. Available online 19 January 2017. Published: January 19, 2017 Highlights Tau pathology induces spatial memory deficits in old, but not young, EC-Tau mice Aged EC-Tau mice exhibit grid cell hypoactivity and reduced periodicity Excitatory, but not inhibitory, MEC neurons are vulnerable to tau pathology Altered neuronal activity correlates with neurodegeneration in old EC-Tau The earliest stages of Alzheimers disease (AD) are characterized by the formation of mature tangles in the entorhinal cortex and disorientation and confusion when navigating familiar places. The medial entorhinal cortex (MEC) contains specialized neurons called grid cells that form part of the spatial navigation system. Here we show in a transgenic mouse model expressing mutant human tau predominantly in the EC that the formation of mature tangles in old mice was associated with excitatory cell loss and deficits in grid cell function, including destabilized grid fields and reduced firing rates, as well as altered network activity. Overt tau pathology in the aged mice was accompanied by spatial memory deficits. Therefore, tau pathology initiated in the entorhinal cortex could lead to deficits in grid cell firing and underlie the deterioration of spatial cognition seen in human AD. tau pathology Alzheimers disease entorhinal cortex grid cells neuronal loss cognitive deficits neurofibrillary tangles spatial memory electrophysiology hypoactivity Figure 1. Figure 2. Figure 3. Figure 4.